Mutagénesis de sitio dirigido

La mutagénesis de sitio dirigido, también llamada mutagénesis dirigida, es una técnica de biología molecular utilizada para crear mutaciones puntuales en una cadena de ADN.

La técnica fue desarrollada por primera vez en 1978 por el científico Michael Smith, al cual le concedieron el Premio Nobel de Química en octubre de 1993 junto a Kary B. Mullis, el creador de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, acrónimo del inglés polimerase chain reaction). Un requisito indispensable para el uso de esta técnica es que se debe conocer la secuencia de ADN que se quiere mutar.^[1]

Mecanismo

El proceso, en primer lugar, requiere sintetizar un fragmento corto de ADN, el cebador, que contenga la mutación. El cebador debe hibridar con la molécula simple (unicatenatenaria) de ADN que contiene el gen de interés. Utilizando una ADN polimerasa, se elonga la cadena (el fragmento unicatenario más el cebador) incorporando la mutación al ADN y formando una molécula de ADN completa bicatenaria. Dicha doble cadena de ADN puede ser introducida en una célula hospedadora y clonada. Tras esto, se escogen los mutantes.

Esta técnica no sólo hace posible crear mutaciones puntuales en una molécula de ADN, sino que también se pueden producir deleciones e inserciones. Se consigue controlar el tipo de mutación que se pretende realizar en el ADN modificando el cebador. Para las deleciones se utilizan cebadores que contengan la deleción pero que tengan la capacidad de hibridación en la cadena de ADN en el sitio correcto; por el contrario, para una inserción el cebador deberá llevar el fragmento extra de ADN además de hibridar correctamente con la cadena molde.

La primera vez que se introdujeron cambios predefinidos en una secuencia conocida del ADN, se utilizaron bacteriófagos X174 am3. Se utilizaron dos tipos de oligodesoxirribonucleótidos[1] complementarios con el ADN vírico desde las posiciones 582 hasta la 593: Uno de ellos era perfectamente complementario con la hebra de ADN del bacteriófago silvestre y la otra poseía una mutación puntual (una A por una G en la posición 587). Tras la hibridación de las cadenas y la elongación con la ADN polimerasa, se transformaron las bacterias y se vieron los resultados, con un 15% de éxito.^[2]

Mutagénesis de sitio dirigido por PCR

Para realizar mutagénesis de sitio dirigido, también se puede utilizar la PCR obteniendo el mismo resultado. Generalmente, se suelen utilizar 4 cebadores: dos de ellos presentan la mutación; y los otros dos únicamente se utilizan para amplificar la cadena (véase figura 1). Puesto que con la PCR obtendremos una amplificación exponencial, el fragmento mutado se amplificará de tal manera que superará mayoritariamente al número de cadenas silvestres sin la mutación. Tras la PCR, podemos despreciar el número de cadenas de ADN silvestre en comparación con las que han sido mutadas.^[3]

Aplicaciones en el diagnóstico

La mutagénesis dirigida es una potente técnica con la que se puede realizar diagnósticos claros y seguros de una manera muy económica. Con esta técnica, es posible detectar mutaciones específicas o repeticiones de nucleótidos. Generalmente, el diagnóstico de algunas enfermedades poco frecuentes, como las del MERRF y la fibrosis quística, se lleva a cabo en los laboratorios mediante el uso de esta técnica.^{[4] [5] [6]}

Referencias

1. ↑ Sandra Clyde A.Hutchison, Edgell Marshal H, Patricia Gillam Shirley y Michael Smith: "Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Secuence", The Journal of Biological Chemistry, Vol. 253, No. 18, Issue 25, pp. 6551-6560. 1978.
2. ↑ Sandra Clyde A.Hutchison, Edgell Marshal H, Patricia Gillam Shirley y Michael Smith: "Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Secuence", The Journal of Biological Chemistry, Vol. 253, No. 18, Issue 25, pp. 6551-6560. 1978.
3. ↑ Steffan N. Ho, Henry D. Hunt, Robert M. Horton, Jeffrey K. Pullen y Larry R. Pease: "Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction", Gene, 77, 41-49. 1989.
4. ↑ ONIM Mutagénesis de sitio dirigido.
5. ↑ GeneTest-Testing MERRF.
6. ↑ GeneTest-Testing CFRTR-Related Disorders (CFTR: Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, o regulador de la conductancia transmembranal en la fibrosis quística).